本实验以3种物料与糖榜样比例的水果酵素为研究工具，研究其在发酵周期0～150d差别发酵时期的微生物动静变更以及7种主要有机酸变更历程，应用冗余剖析对微生物群落组成与有机酸变更团结剖析，以期揭示水果酵素在天然发酵历程中的微生物共性演化规则及在演替历程中有机酸的环境推进力，为指导天然发酵水果酵素现实制造、实现水果酵素工业制造工艺改进和产品品格稳定晋升提供技术支持。
01
质料与技巧
质料与试剂
苹果、香蕉、梨、山楂、火龙果、香橙、柠檬、柚子、葡萄、猕猴桃、红糖（一级品）、白砂糖（一级品）。
有机酸规范品；十六烷基三甲基溴化铵、十二烷基硫酸钠；β-巯基乙醇、丙烯酰胺、甲叉双丙烯酰胺、去离子甲酰胺；RNase、6×loading bufferv；PCR引物；其余均为国产剖析纯。
仪器与装备
K5600型超微量分光光度计；MultiskanFC酶标仪；TGL16M高速台式离心机；1260高效液相色谱仪；S1000TMPCR仪、Power Pac电泳仪；Tanon4600SF全自动数码凝胶/化学发光图像剖析体系。
技巧及数据剖析
选取原料水果，等质量比混匀，无菌水洁净表面，匀称切块。连结预实验发酵环境与其余研究选定糖与物料的比例与发酵时间，将水果与红糖以质量比1∶1、2∶1、3∶1（水果酵素A、B、C）加入灭菌发酵罐中，封口，天然发酵，分别在发酵0、30、60、90、120d取样，10000r/min离心10min弃去积淀，上清液即为水果酵素原液，-20℃条件下留存，进行有机酸含量测定、微生物多样性剖析，并接纳应用Quantity One读取DGGE图谱上条带的数量与光密度值，并进行UPMGA（非加权组平衡算法）聚类剖析，生成DGGE图谱类似性剖析图，并凭据DGGE数字化后的数据计较微生物多样性指数，包含微生物多样性指数、富厚度和匀称度指标。
02
后果与剖析
有机酸的测定后果
图1有机酸规范品（A）与样品A 0 d(B）高效液相色谱图
1.酒石酸；2.奎宁酸；3.草酸；4.苹果酸；5.莽草酸；6.抗坏血酸；7.乳酸；8.柠檬酸；9.富马酸；10.琥珀酸。
乳酸、柠檬酸、草酸和苹果酸是水果酵素中的主要有机酸，同时还含有少量的酒石酸、莽草酸和绿原酸。
图2水果酵素A、B、C在发酵历程中有机酸含量的变更
A、B、C分别为水果酵素A、B、C有机酸含量变更。**.统一样品与上一时间点相比差异极显著（P<0.01）。
如图2所示，在发酵前后酵素中主要有机酸含量均产生变更。别的，差别样品在发酵差别阶段有差别的有机酸变更，水果酵素A的草酸与柠檬酸在发酵30d出现峰值，乳酸在发酵90d出现峰值；水果酵素B的草酸与乳酸在发酵60d出现峰值，柠檬酸在90d含量非常高；水果酵素C的草酸在发酵60d出现非常大值，在发酵90d乳酸与柠檬酸出现非常大值。差别糖与物料比的水果酵素在天然发酵历程中可以有针对性地选定合适的发酵阶段，保证酵素功效品格。
水果酵素发酵历程中的微生物多样性
图3水果酵素的细菌16S r DNA V3区DGGE指纹图谱（A）及条带简图（B)
a～q为选取的电泳条带；1～18.酵素细菌的DGGE泳道，此中1～3为发酵0d酵素A、B、C,4～6为发酵30d酵素A、B、C,7～9为发酵60d酵素A、B、C,10～12为发酵90d酵素A、B、C,13～15为发酵120d酵素A、B、C,16～18为发酵150d酵素A、B、C，图4、5同。
如图3所示，每条泳道代表差别发酵时间的水果酵素细菌的DGGE图谱，差别位置的条带则代表差别种属的微生物，条带亮度反映微生物品貌崎岖，条带数量代表菌落多样性。由图3可知，各条带的迁徙率及光密度值均有必然差异，可以校验3种水果酵素在发酵历程中细菌品种和含量均在接续产生演替变更。
从18份样品的DGGE图谱上共标志出19条特异性条带，对条带进行克隆测序，将检验出的条带序列在NCBI数据库中进行BLAST比对剖析，后果如表1所示。
表1差别发酵阶段的水果酵素样品中细菌16S rDNA V3区PCR-DGGE特异性条带鉴定后果
由表2可知，在水果酵素样品细菌DNA的DGGE图谱上找到19条特异性条带，对其进行剖析的后果为：7株乳酸菌，2株琼脂酶产生菌，2株肠杆菌、1株肠球菌，2株假单胞菌，以及3株不行培养微生物，另外有2株菌未检验到。
本研究发现差别的糖与物料比影响水果酵素初始环境的渗透压，也影响发酵历程中多种微生物群落的含量变更和优势菌群，所以在相像发酵阶段，差别样品的泳道条带数与亮度存在异同。统一样品在差别发酵阶段的菌群变更也十分明显。
PCR-DGGE后果聚类剖析
图4水果酵素的细菌DGGE指纹图谱聚类剖析
如图4所示，0d与其余阶段酵素的细菌菌群类似性较小，介绍酵素在发酵后菌群变更较大；30d后的水果酵素类似性较大，此中水果酵素B、C发酵30d与60d样品较为接近，与0d样品具备较为明显的差异，不妨因为水果酵素B、C在该阶段有类似度较高的细菌种群布局。除此以外，水果酵素A在60d与90d的群落较为相近，不妨水果酵素A在发酵历程中的细菌菌群交替发展的后果。
细菌种群多样性PCR-DGGE剖析
由表2可知，差别样品中细菌种群的匀称度较为接近，不过富厚度和多样性指数差别较大。0d时样品具备较高的富厚度和多样性，不妨因为发酵初期菌群不稳定，微生物均为果蔬里面或表皮佩戴的天然菌群；跟着发酵进行，片面细菌渐渐占有优势职位，可以保持菌群布局的稳定。在发酵后期，泳道18（水果酵素C发酵150d）中多样性指数和品貌非常高，分别为2.76和16.00，不妨因为该发酵阶段优势菌群衰竭，也可能因为杂菌的玷污。此后果和DGGE图谱的直观观测后果一致。
表2水果酵素细菌菌群多样性剖析
关联性剖析
RDA后果见表3，第1轴与第2轴特性值分别为0.396和0.150，微生物群落与有机酸的关联性分别为0.958和0.950，累积榜样特性值为0.688，蒙特卡罗检验值小于0.05，所以排序后果可以在必然程度上注释微生物群落组成与环境有机酸含量之间的互相关系。
表3 RDA后果
从图5可知，差别时期的样品主要分布在3个区域。
图5微生物群落与有机酸变更RDA
03
论断
本研究使用RDA技巧对微生物在水果酵素发酵历程中微生物组成布局变更与标志性产物有机酸之间的对应关系进行了研究，证实了RDA在微生物群落变更与有机酸关联性剖析中的可行性，确定在发酵历程中与特性物质生成与代谢相关的主要微生物，对阐明水果酵素发酵历程、指导水果酵素制造加工技术有紧张参考代价。RDA表明对柠檬酸生成进献率较大的菌株分别为L.plantarum>unculturedBrevundimonassp.>E.xiangfangensis>unculturedLactococcus sp.，对乳酸生成进献率较大的菌株分别为L.plantarum>L.lactissubsp.>E.xiangfangensis>L.lactissubsp.>unculturedLactococcus sp.。
